Megazyme K-AMYL直链淀粉试剂盒说明书
前言:
谷类淀粉的许多特性决定其最终用途，这些取决于直链淀粉/支链淀粉的比率。这些特性包括糊化和凝胶化，溶解度，抗性淀粉的形成以及整颗大米的烹饪和构造特性。因此，淀粉中直链淀粉含量的测定是淀粉加工的一个重要的质量参数。
最常用的测定谷物淀粉中直链淀粉含量的方法是利用电势，电流测定或直链淀粉的碘结合能力比色测定直链淀粉-碘色合配合物。然而，这些方法具有不确定性。支链淀粉-碘复合物也可以形成，这样降低了利用非比色法测定的游离碘离子的浓度，并且用比色法测量时，该复合物可能和直链淀粉-碘复合物吸收相同波长的光。这种复合物致使直链淀粉的测定含量超过实际含量，需要进行校正。Gibson等详细列举了使用这些方法所遇到的许多其他问题。
支链淀粉结合ConA的特殊复合物为淀粉中直链淀粉的测定提供了一种替代方法，而且不存在不确定性问题。在指定pH值，温度和离子强度的条件下，ConA特异性结合分支多糖并形成沉淀，这种结合以多个非还原性末端基团上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基单位为基础。因此，ConA可以有效结合淀粉中的支链淀粉成分，但是不能结合线性为主的直链淀粉成分。
此方法是Yun和Matheson改进的ConA方法。分析之前用乙醇预处理去除脂质。
原理：
淀粉样品通过加热完全地溶解在二甲基亚砜（DMSO）里。用乙醇沉淀淀粉去除其中的脂质，回收沉淀的淀粉。用醋酸/盐溶液溶解沉淀的样品，加入ConA，特异性沉淀支链淀粉，离心去除沉淀。单位体积上清液中的直链淀粉用酶水解为D-葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂进行测定。另外一份单位体积醋酸/盐溶液中的总淀粉同样用酶水解为D-葡萄糖，然后加入葡萄糖氧化酶/过氧化物酶，用比色法测定。
根据ConA沉淀样品的上清液和与总淀粉样品中的GOPOD在510 nm处的吸光光度值之比判断直链淀粉在总淀粉中的含量。
该方法适用于所有的纯淀粉和谷物粉。
精确性
样品如为纯淀粉，相对标准偏差为<5%。
样品如为谷物面粉，相对标准偏差为～10%。
谷类淀粉的许多特性决定其最终用途，这些取决于直链淀粉/支链淀粉的比率。这些特性包括糊化和凝胶化，溶解度，抗性淀粉的形成以及整颗大米的烹饪和构造特性。因此，淀粉中直链淀粉含量的测定是淀粉加工的一个重要的质量参数。
最常用的测定谷物淀粉中直链淀粉含量的方法是利用电势，电流测定或直链淀粉的碘结合能力比色测定直链淀粉-碘色合配合物。然而，这些方法具有不确定性。支链淀粉-碘复合物也可以形成，这样降低了利用非比色法测定的游离碘离子的浓度，并且用比色法测量时，该复合物可能和直链淀粉-碘复合物吸收相同波长的光。这种复合物致使直链淀粉的测定含量超过实际含量，需要进行校正。Gibson等详细列举了使用这些方法所遇到的许多其他问题。
支链淀粉结合ConA的特殊复合物为淀粉中直链淀粉的测定提供了一种替代方法，而且不存在不确定性问题。在指定pH值，温度和离子强度的条件下，ConA特异性结合分支多糖并形成沉淀，这种结合以多个非还原性末端基团上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基单位为基础。因此，ConA可以有效结合淀粉中的支链淀粉成分，但是不能结合线性为主的直链淀粉成分。
此方法是Yun和Matheson改进的ConA方法。分析之前用乙醇预处理去除脂质。
原理：
淀粉样品通过加热完全地溶解在二甲基亚砜（DMSO）里。用乙醇沉淀淀粉去除其中的脂质，回收沉淀的淀粉。用醋酸/盐溶液溶解沉淀的样品，加入ConA，特异性沉淀支链淀粉，离心去除沉淀。单位体积上清液中的直链淀粉用酶水解为D-葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂进行测定。另外一份单位体积醋酸/盐溶液中的总淀粉同样用酶水解为D-葡萄糖，然后加入葡萄糖氧化酶/过氧化物酶，用比色法测定。
根据ConA沉淀样品的上清液和与总淀粉样品中的GOPOD在510 nm处的吸光光度值之比判断直链淀粉在总淀粉中的含量。
该方法适用于所有的纯淀粉和谷物粉。
精确性
样品如为纯淀粉，相对标准偏差为<5%。
样品如为谷物面粉，相对标准偏差为～10%。
试剂盒：
瓶子1：冻干的Con A (伴刀豆球蛋白 A concanavalin A) ，200 mg，-20℃下稳定性>5年。
瓶子2：淀粉葡糖苷酶【200U，条件为消化对硝基苯基β-麦芽糖苷(也就是3300U，条件为pH4.5，40℃下消化淀粉)】加上真菌α-淀粉酶(500U ，条件为pH5.0，40℃下消化 Ceralpha 试剂)，2mL，4℃下稳定性>5年。
瓶子3：GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M，pH7.4)，对羟苯甲酸(0.22M)和叠氮化钠(0.02% W/W)。4℃下稳定性> 3年。
瓶子4：GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉，-20℃下稳定性>5年。
瓶子5：D-葡萄糖标准溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室温下稳定性>5年。
瓶子6：淀粉参考样品(含有特定含量的直链淀粉)，室温下稳定性>5年。
瓶子1：冻干的Con A (伴刀豆球蛋白 A concanavalin A) ，200 mg，-20℃下稳定性>5年。
瓶子2：淀粉葡糖苷酶【200U，条件为消化对硝基苯基β-麦芽糖苷(也就是3300U，条件为pH4.5，40℃下消化淀粉)】加上真菌α-淀粉酶(500U ，条件为pH5.0，40℃下消化 Ceralpha 试剂)，2mL，4℃下稳定性>5年。
瓶子3：GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M，pH7.4)，对羟苯甲酸(0.22M)和叠氮化钠(0.02% W/W)。4℃下稳定性> 3年。
瓶子4：GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉，-20℃下稳定性>5年。
瓶子5：D-葡萄糖标准溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室温下稳定性>5年。
瓶子6：淀粉参考样品(含有特定含量的直链淀粉)，室温下稳定性>5年。
试剂制备的准备：
1、用50mlCon A试剂将瓶子1中药品溶解，分成适当的几部分存放在聚丙烯管中，尽可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下稳定性>2年。
2、用20ml醋酸钠缓冲液将瓶子2中的药品溶解，分成适当的几部分存放在聚丙烯管中，尽可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下稳定性>2年。
2、用20ml醋酸钠缓冲液将瓶子2中的药品溶解，分成适当的几部分存放在聚丙烯管中，尽可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下稳定性>2年。
3、用蒸馏水将中的药品（GOPOD 试剂缓冲液）稀释至1L。现配现用。
(注意：如果瓶子3意外存放在-20℃下，一些盐可能会结晶。配制时要确保所有的结晶物质都溶解在1L的蒸馏水中）
4、用20ml GOPOD 试剂缓冲液溶解GOPOD试剂酶，并定量的转移到存放GOPOD 试剂缓冲液的瓶子中，用铝箔封住瓶子，避光保存。这种试剂黑暗中保存，2-5℃下能保存大约3个月，-20℃下稳定性大于12个月。
5、按提供的方法使用D-葡萄糖标准溶液和淀粉参考样品，室温下稳定性>5年。
安全考虑：
1、DMSO对皮肤有刺激性，用的时候要格外小心。它通过皮肤被吸收，对皮肤和眼睛都有刺激性。穿保护装、戴手套，避免溶剂溅出。尽可能在通风橱中进行试验。
2、ConA通过呼吸、皮肤接触或摄入体内，对人体是十分有害的。这种伤害不可逆转，可能会致畸。在使用ConA结晶体球蛋白和含有ConA的溶剂时要穿保护装、戴手套和特制的面具。
3、叠氮化钠是有毒的化学试剂，必须要有专门的处理。它要添加特殊的缓冲液来充当防腐剂。毒性通过缓冲可以被消除，但是缓冲液必须在4℃下保存。
缓冲液或溶剂：
1、乙酸钠缓冲液（10mM,pH 4.5）
加5.9ml1.05g/ml的冰醋酸到900ml的蒸馏水中用4g/100ml的NaOH溶液调pH到4.5（大约30ml）,加0.2g叠氮化钠，用蒸馏水定容至1L。室温下稳定性>2年。
2、ConA 浓缩液(600 mM, pH 6.4 乙酸钠缓冲液)
称取49.2g无水醋酸钠，175.5g氯化钠，0.5gCaCl2.2H2O ，0.7 gMgCl2.6H2O 和0.7 g MnCl2.4H2O ，用900 mL 蒸馏水将其溶解逐滴加入冰醋酸调pH为6.4，再用蒸馏水定容至1L。4℃下保存2周。（注意：配制这种复合缓冲液时，pH的调节特别重要，如果pH低于6.4，就会有沉淀物形成，就算pH再调回来，沉淀物也不会溶解。结果会导致缓冲液必须丢弃重新配制。）
3、ConA 溶液（使用浓度）
将30ml ConA 浓缩液用蒸馏水稀释至100ml。现配现用。
4、DMSO
分析纯试剂。室温下可保存5年。
预处理：淀粉样品事先用乙醇进行预处理，除去脂质。如果样品没有用乙醇进行预处理，在某些样品中测得的直链淀粉含量会低50%。
实验步骤：
A、淀粉预处理
1、准确称取淀粉或面粉样品至10ml的样品管中。记录样品重量精确到0.1mg。
2、加1ml DMSO至试管，在漩涡混合器中慢速混匀，在沸水浴中加热直至分散（大约1分钟）确保淀粉没有结团结块。
3、密封试管，高速混匀。沸水浴加热15min，再高速间歇混匀。
4、室温放置大约5min，加2ml 95%乙醇，混匀，再加4ml乙醇，盖上盖子，颠倒混匀。形成淀粉沉淀物，将试管静止15min（条件允许过夜静止）。
5、2000r,5min离心，弃去上清液，倒置在纸巾上10min,确保乙醇全部挥发。在接下来直链淀粉和淀粉的测定中使用此沉淀物。
6、加2ml DMSO到淀粉沉淀物中，将试管沸水浴15min(间或混匀)，确保没有块状。
7、从沸水浴中取出试管，立即加入4ml ConA 溶液，将试管中药品转移至25ml容量瓶中。用 ConA 溶液定容。
（整个过程必须在2h内完成）
B、支链淀粉- ConA 沉淀物和直链淀粉的测定
1、量取1mlA试剂到2ml的试管中，加0.54ml的ConA 溶液，盖上盖子，反复颠倒，混匀。避免样品起泡。
2、室温静置1h。14000r，10min，室温下离心。
3、转移1ml的上清液到15ml的离心管中，，加3ml100mM醋酸钠缓冲液，pH4.5，混合药品。轻轻塞住管口，沸水浴5min，使ConA变性。
4、将试管在40℃下水浴，平衡5min，，加1ml淀粉转葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物，40摄氏度下反应30min，2000r离心5min。
5、准确量取1ml上清液，加4ml GOPOD试剂，40摄氏度下反应20min，使空白试剂和D-葡萄糖标准液同时反应。
6、在510nm下测定每一个样品和D-葡萄糖标准液的吸光光度值。
C、总淀粉的测定
1、将0.5mlA溶液和4ml100mM乙酸钠溶液混合，pH 4.5
2、加1ml淀粉转葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物，40摄氏度下反应10min，
3、准确量取1ml上清液，加4ml GOPOD试剂，40摄氏度下反应20min。这个反应必须让样品和标准液按B部分同时进行。